Cefixima 86

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Mecanismo de la eficacia terapéutica de cefixima contra la fiebre tifoidea RESUMEN-lactámicos han sido considerados ineficaces contra los organismos que crecen dentro de las células de mamíferos, debido a su escasa penetración en las células. Sin embargo, la cefixima se ha demostrado ser clínicamente eficaz contra la fiebre tifoidea. El mecanismo probable de la eficacia terapéutica de cefixima contra la fiebre tifoidea se investigó usando Salmonella enterica serovar Typhimurium en lugar de S. enterica serovar Typhi tanto en un celular y en un modelo de ratón de infección. Cefixima fue capaz de inhibir el crecimiento de serovar Typhimurium que habitan las células THP-1 derivadas de monocitos. se observó Alargamiento de serovar Typhimurium en las células THP-1 microscópicamente. cambios morfológicos aparentes de serovar Typhimurium en las células THP-1 también se observaron por microscopía electrónica. La concentración de cefixima dentro de las células THP-1 era casi la mitad (46 a 48) de la concentración fuera de las células cuando serovar Typhimurium coexistieron en la solución. El período de tiempo después de la administración oral (8 mg / kg) que la cefixima se presentcalculated de los niveles en serumat una concentración por encima de la CMI en el que se inhibieron 90 de los organismos de serovar Typhi dentro de las células humanas se presume que es más de 12 h. Cefixima también mostró una excelente actividad en los modelos de infección oral y sistémica del ratón sobre la base de las infecciones causadas por serovar Typhimurium. Se concluye que una buena cantidad de cefixima puede entrar en las células de mamíferos y de inhibir el crecimiento de bacterias dentro de las células cuando las bacterias son lo suficientemente sensibles a la cefixima, como lo son las serovariedades Typhimurium y Typhi. La fiebre tifoidea sigue siendo uno de los principales problemas de salud pública en los países en desarrollo. Por otra parte, una resistencia transferibles plásmido que codifica al cloranfenicol, cotrimoxazol, ampicilina y se ha extendido a Salmonella enterica serovar Typhi en muchos países (7. 14. 17. 19, 22). Este cambio de tendencia en la susceptibilidad antibiótica de serovar Typhi ha fomentado el uso de nuevos agentes, tales como oximino-cefalosporinas y quinolonas, para el tratamiento de la fiebre tifoidea causada por cepas resistentes a múltiples fármacos. Aunque la resistencia a estos agentes se ha observado en algunos casos, es inferior a la de serovar Typhi a los agentes más antiguos (1-3. 7-9. 14. 15. 17. 18, 20. 22). Mientras que la fuerte actividad in vitro de nuevas cefalosporinas contra bacterias enteropatógenas es bien sabido, estos fármacos han sido considerados ineficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas entéricas causadas por organismos tales como Typhi serovar crecido en células de mamífero. Los estudios clínicos recientes han demostrado una excelente eficacia de cefixima y ceftriaxona contra la fiebre tifoidea (3. 9), que se puede considerar una infección sistémica en lugar de una infección intestinal local, como la shigelosis. Cefixima (21), la primera cefalosporina de espectro extendido oral, tiene una fuerte actividad contra serovar Typhi (MIC en la que 90 de las cepas son inhibidas MIC 90 de 0,25 g / ml) (13), y su utilidad clínica también se ha demostrado en varios estudios (3, 7-9. 14. 17. 18). Esta actividad es comparable a las de ceftriaxona (3. 9) y las nuevas quinolonas (1. 2. 15, 20. 22). El mecanismo de su eficacia terapéutica se investigó en un modelo in vitro usando Salmonella serovar Typhimurium en lugar de serovar Typhi, que no causa la morbilidad en los ratones. Materiales y métodos Cepas bacterianas. Se han usado clínicamente aislado Salmonella serovar Typhimurium FP39, LT2 (cepa virulenta), y FP1671 (-1 de tipo TEM productor de b-lactamasa). Por vía oral serovar typhimurium virulenta C5 (10) fue proporcionado amablemente por Takeshi Sasahara, de la Universidad de Kitasato (Sagamihara, Japón). Las células humanas. Se utilizaron células derivadas de monocitos THP-1 de Dainippon Pharmaceutical Co.. Antibióticos. Cefixima (Fujisawa), amoxicilina (Fujisawa), ciprofloxacina (Bayer) y cloranfenicol (Sankyo), utilizado en los estudios in vivo, y se obtuvieron comercialmente ceftriaxona (Roche). La cefixima, ceftizoxima, amoxicilina, y ciprofloxacino utilizado en los estudios in vitro se sintetizaron en nuestros laboratorios. Las pruebas de sensibilidad. MICs se determinaron con diluciones en serie de antibióticos en agar Mueller-Hinton (Difco), con tamaños de inóculo de 10 4 UFC por punto. La MIC se definió como la concentración más baja de antibiótico que inhibe el crecimiento visible después de 18 h de incubación a 35ºC. efecto protector contra la infección sistémica causada por ratón serovar Typhimurium. Se utilizaron ratones macho ICR (4 semanas de edad). serovar Typhimurium cepas se cultivaron durante la noche en agar tripticasa de soja (BBL) a 35ºC y se suspendieron en solución salina. Una porción de 0,2 ml que contiene aproximadamente una dosis letal mínima (MLD) (determinado en el día 21 después de la infección) se inoculó por vía intravenosa en cada ratón. Ocho ratones fueron asignados a cada grupo. Los antibióticos se administraron por vía oral dos veces al día en dosis de 160, 40, 10, 2,5, y 0,625 mg / kg de peso corporal, de 1 día después de la infección durante 3 días. efecto protector frente a la infección oral de ratón causada por serovar typhimurium C5. Se utilizaron ratones BALB / c de 4 semanas de edad, machos. Por vía oral serovar Typhimurium virulenta C5 (4,4 10 7 CFU en 0,2 ml de solución salina / ratón, 1 MLD) se inoculó por vía oral. Los antibióticos se administran por vía oral dos veces al día durante 5 días, desde el día 3 hasta el día 7 después de la infección. La viabilidad de las células THP-1 después de la infección con serotipo Typhimurium FP39. La actividad antibacteriana de cefixima de serovar Typhimurium dentro de las células THP-1 se evaluó mediante la determinación de la viabilidad de las células THP-1 a las 6 h después de la infección con serovar Typhimurium FP39. Las células se colorean utilizando un kit LIVE / DEAD reducción de la viabilidad de riesgo biológico / citotoxicidad de Molecular Probes. Los resultados se analizaron por FACScan y LysysII (Becton Dickinson). Los cambios morfológicos de serovar Typhimurium dentro de las células THP-1 causadas por la presencia de cefixima. Los cambios morfológicos de serovar Typhimurium FP39 en células THP-1 fueron estudiadas mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión. THP-1 células infectadas fueron tratadas durante 4 h con 0,5 g de cefixima / ml. La actividad bactericida de cefixima de serovar Typhimurium dentro de las células THP-1. Para excluir el efecto de la actividad bactericida de cefixima de serovar Typhimurium fuera de las células THP-1, se controlaron los recuentos de células viables de serovar Typhimurium dentro de las células THP-1. Después de 1 h de incubación de células THP-1 con serovar Typhimurium, las células se trataron con 50 g de gentamicina / ml durante 30 min para eliminar las bacterias fuera de las células y se lavaron tres veces con el mismo medio antes de la adición de cefixima . soluciones celda de muestra se lavaron una vez con el medio y se lisaron mediante suspensión en el mismo volumen de agua destilada estéril, y las bacterias viables se contaron con un método de chapado convencional. La penetración de los antibióticos en células THP-1. La penetración de los antibióticos en células THP-1 se determinó por medio de una técnica de centrifugación en gradiente de velocidad (11. 12). Los antibióticos se añadieron a las suspensiones de células THP-1 a concentraciones de 10 o 50 g / ml. Las mezclas de células antibiótico se incubaron a 37ºC en 5 CO 2 durante 30 min. Las concentraciones de antibióticos se determinó por bioensayo. También se evaluó el efecto de la coexistencia de cefixima con serovar Typhimurium. THP-1 células fueron incubadas con serovar Typhimurium FP39 en una proporción de 1: 5 para 1 h a 37ºC en 5 CO 2. seguido de incubación con cefixima durante 30 min en las mismas condiciones. RESULTADOS La actividad antibacteriana de cefixima contra la Salmonella typhimurium. La Tabla 1 muestra las CIMs de los antibióticos para las cepas serovar Typhimurium utilizados. La sensibilidad de estas cepas a los antibióticos ensayados fue similar a la sensibilidad de cepas de Salmonella serovar Typhi (13). MIC de antibióticos para las cepas de serotipo Typhimurium eficacia terapéutica de cefixima en una infección sistémica causada por ratón serovar Typhimurium. Para confirmar la eficacia clínica de cefixima contra la fiebre tifoidea, se evaluó la eficacia in vivo de cefixima en un modelo de ratón de infección sistémica basado en infecciones causadas por serovar Typhimurium FP39, FP1671, y LT2 (Tabla2). Contra FP39, de 3 días de cefixima demostraron actividad terapéutica potente, con una dosis efectiva 50 (ED 50) de 1,48 mg / kg a los 14 días después de la infección, mientras que el DE 50 s de los otros tres antibióticos eran más de 10 veces mayor. El efecto terapéutico de cefixima en un modelo de infección sistémica de ratón con serovar Typhimurium un Cefixima también mostró actividad terapéutica contra la cepa amoxicilina resistente lactamasa productoras FP1671 de serovar Typhimurium, aunque el ED 50 fue mayor que para FP39. Sin embargo, las dosis de 320 mg cada una de amoxicilina y cloranfenicol por kg por día tenían casi ningún efecto sobre esta cepa. El ED 50 de ciprofloxacino era similar a la de la cefixima para esta cepa, aunque su MIC fue menor que la de cefixima. Contra serovar typhimurium LT2 (cepa virulenta), cefixima mostró actividad terapéutica potente, con DE 50 s de 1,48 mg / kg después de 6 días y 32,6 mg / kg después de 14 días. La fuerte actividad in vitro de cefixima correlaciona bien con su actividad terapéutica in vivo. Por otro lado, la ED 50 de ciprofloxacino fue mayor que la de la cefixima, a pesar de que la MIC era el mismo. La eficacia terapéutica de cefixima en ratón de infección oral causada por el serotipo Typhimurium C5. A 4 mg / kg / día dosis de cefixima demostraron actividad terapéutica potente en este modelo, y las cifras de dosificación para la amoxicilina, cloranfenicol y ciprofloxacina fueron 20, 100, y 20 mg / kg / día, respectivamente (Fig. 1). El efecto terapéutico de cefixima en un modelo de ratón de infección oral. Male ratones BALB / c de 4 semanas de edad (10 / grupo) fueron infectados por vía oral con 4,4 10 7 UFC de serovar Typhimurium C5 por ratón y se trataron por vía oral con cefixima dos veces al día durante 5 días, comenzando 3 días después de la infección. La viabilidad de las células THP-1 después de la infección con serotipo Typhimurium FP39. La viabilidad de las células THP-1 a las 6 h después de la infección con serovar Typhimurium FP39 se redujo a 65, en comparación con 98 en el control negativo. A 1-g / ml concentración de cefixima aumentó la viabilidad a 94, y 10 g de cefixima / ml aumentó la viabilidad a 97. Los cambios morfológicos de serovar Typhimurium dentro de las células THP-1 inducida por la presencia de cefixima. Después de 4 h de tratamiento con 0,5 g de cefixima / ml, el alargamiento evidente de serovar Typhimurium FP39 dentro de las células THP-1 se observó, aunque las bacterias no eran tan largos como los fuera de las células THP-1 (Fig. 2). La Figura 3 muestra micrografías que detallan los cambios morfológicos de serovar Typhimurium FP39 en células THP-1, según lo revelado por microscopía electrónica de transmisión. cambios morfológicos aparentes también se observaron dentro de las células bacterianas. Aunque la concentración de cefixima dentro de las células THP-1 parecía ser menor que fuera de las células, que era capaz de causar daños reales a serovar Typhimurium. Cefixima-indujo cambios morfológicos de serovar Typhimurium FP39 dentro de las células THP-1. (A) Control (B) las células THP-1 infectadas después del tratamiento de 4 h con 0,5 g de cefixima / ml. cambios Cefixima inducida morfológicas de serovar Typhimurium FP39 dentro de las células THP-1 (microscopía electrónica de transmisión). (A) Control (B) las células THP-1 infectadas después del tratamiento de 4 h con 0,5 g de cefixima / ml. , Serovar Typhimurium dentro de las células THP-1. La actividad bactericida de cefixima de serovar Typhimurium dentro de las células THP-1. Cefixima fue capaz de inhibir el crecimiento de serovar Typhimurium FP39 que habitan las células THP-1 a 1 g / ml y fue capaz de disminuir el número de CFU a 10 g / ml. Cefixima también era activo contra el FP1671 cepa resistente a amoxicilina-lactamasa que producen. Las altas concentraciones de cefixima fueron capaces de matar con eficacia serovar Typhimurium dentro de las células THP-1. La actividad bactericida de cefixima de serovar Typhimurium dentro de las células THP-1. , Control, 1 g / ml, 10 g / ml, 100 g / ml. La penetración de cefixima en células de mamífero. Las relaciones intracelulares / extracelulares de concentración de cefixima dentro de las células THP-1 fueron 34 a 50 g de cefixima / ml y 28 a 10 g / ml (Tabla 3). La penetración de la cefixima se incrementó a 48 y 46, respectivamente, cuando las células se incubaron con serovar Typhimurium. Los valores de penetración para ceftizoxima, ceftriaxona, y amoxicilina fueron 29, 31 y 35, respectivamente. En las mismas condiciones, la penetración de la ciprofloxacina fue de 600, lo que parece indicar captación activa (5). La penetración de cefixima en células de mamíferos y el efecto de la presencia del serotipo Typhimurium Terapia discusión con nuevas quinolonas y betalactámicos se ha introducido para hacer frente a Salmonella serovar Typhi resistente a múltiples fármacos. Esto fue seguido rápidamente por la aparición de serovar Typhi resistente a las quinolonas (16. 23). Wistrom y Norrby a recomendar que la quinolonas para el tratamiento empírico precoz de los pacientes gravemente enfermos y vulnerables, a pesar de que son muy eficaces en el tratamiento de enteritis bacteriana causada por diversos organismos, debido al alto riesgo de la rápida evolución de la resistencia (24). Además, no se recomiendan las quinolonas para el tratamiento de los niños, que a menudo requieren urgentemente un tratamiento antimicrobiano eficaz. Algunos lactamasas de espectro extendido inactivar cefalosporinas reciente, tales como la cefixima. Actualmente, sin embargo, la incidencia de espectro extendido - lactamasa o serovar Typhi cephalosporinase productoras es muy baja. La actividad anti-Typhi serovar de cefixima se informó en el Tercer Simposio de Asia y el Pacífico sobre la fiebre tifoidea y otras salmonelosis en Bali en 1997, y los resultados han sido publicados (13). Más de 70 de las cepas fueron inhibidas a menos de 0,031 g de cefixima / ml, y el MIC 90 de cefixima para 73 cepas de Typhi serovar, incluyendo 18 cepas resistentes al cloranfenicol, fue 0,25 g / ml. Esta actividad es comparable a las de la ceftriaxona y la nueva quinolonas ofloxacina y la ciprofloxacina. Las CIMs de cefixima de cepas de Salmonella typhimurium fueron similares a los de las cepas de serotipo Typhi. antibióticos beta-lactama se han considerado ineficaz contra organismos que crecen dentro de las células de mamíferos, tales como los serotipos Typhimurium Typhi y, a pesar de su excelente actividad in vitro, debido a que sus concentraciones dentro de las células de mamífero son mucho más bajos que en el exterior (11. 12). Sin embargo, la eficacia de las cefalosporinas reciente, tales como la cefixima oral para la fiebre tifoidea, se ha demostrado en varios estudios clínicos (3. 7-9. 14. 17. 18). Utilizamos serovar Typhimurium en este estudio, ya que este patógeno, a diferencia de serovar Typhi, causa la infección sistémica en ratones. Además, la susceptibilidad de serovar Typhimurium a los antibióticos probados es similar a la de serovar Typhi, proporcionando un modelo útil para la investigación. Se suponía que la cefixima puede inhibir el crecimiento de bacterias en células de mamífero cuando las bacterias son muy sensibles a la cefixima, como son serotipos Typhimurium y Typhi. Cuán grande podría ser inducida una concentración de cefixima dentro de las células humanas que hemos detectado una fuera de las células 28 a 34 de concentración en ausencia de serovar Typhimurium. Sin embargo, la concentración aumentó a 46 a 48 cuando se incubaron las células con serovar Typhimurium. Esta penetración de cefixima en células THP-1 era comparable a la de otros betalactámicos, tales como ceftizoxima, ceftriaxona, y amoxicilina. Por otra parte, ciprofloxacina, una quinolona, ​​fue tomada activamente. La concentración intracelular se estima a partir de los niveles en suero después de la administración oral de 8 mg de cefixima / kg (6), y la concentración de cefixima dentro de las células era 34. La duración de tiempo por encima de un MIC 90 de cefixima para Typhi serovar, obtenida de la concentración intracelular estimada, era más de 12 h. La fiebre tifoidea es una infección relativamente severa, lo que garantiza una dosis más alta de lo normal para asegurar la eficacia clínica. Los estudios anteriores llevados a cabo con la cefixima para la fiebre tifoidea han utilizado una dosis de 10-20 mg / kg / día (3. 7-9. 14. 17. 18). Un informe preliminar mostró una buena eficacia clínica con una dosis de 10 mg / kg / día (4). Una dosis de 5 a 7,5 mg de cefixima por kg dos veces al día debería dar como resultado un tiempo suficiente de la concentración intracelular encima de la CIM 90 para la eficacia clínica pediátrica contra la fiebre tifoidea. En conclusión, la eficacia de cefixima contra la fiebre tifoidea se presume que venir de su fuerte actividad contra el serovar Typhi y su penetración razonable en monocitos, que se aumentó a alrededor de 47 en la presencia del serovar Typhimurium. Esto fue demostrado por la inhibición del crecimiento de serovar Typhimurium dentro de las células THP-1 diferenciadas a los macrófagos, los cambios morfológicos de serovar Typhimurium dentro de las células THP-1, y el aumento de la viabilidad de las células THP-1 infectadas con el serovar Typhimurium. Una larga vida media que conduce a un tiempo por encima de la MIC dentro de las células de mamíferos también es compatible con la eficacia clínica de la cefixima. Además, cefixima tenía buen efecto terapéutico en un modelo de ratón en base a las infecciones causadas por serovar Typhimurium. La discrepancia entre la actividad terapéutica más débil y fuerte actividad in vitro y de alta penetración en las células de la ciprofloxacina no se entiende completamente. Su farmacocinética y los efectos de la flora intestinal son posibles explicaciones. Los resultados de la presente investigación apoyan la eficacia terapéutica de cefixima oral para el tratamiento de la fiebre tifoidea. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a J. Pitt, T. Hirano, M. Hanyaku, H. Nishio, y T. Harimoto por su apoyo.